I prioni e la proteina prionica

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I prioni e la proteina prionica

Autori: Claudia Y. Acevedo-Morantes and Holger Wille- Department of Biochemistry and Centre for Prions and Protein Folding Diseases, University of Alberta, Edmonton, AB T6G 2M8, Canada- Eric O. Freed 20 October 2014

1. Introduzione
La proteina prionica può esistere in più isoforme, principalmente il PrPC cellulare, non infettivo e il PrPSc che causa la malattia. La proteina prionica è maggiormente espressa nel sistema nervoso centrale (SNC), ma può essere trovata anche in altri tessuti e tipi di cellule. La PrPSc mal ripiegato provoca le malattie da prioni, note anche come encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE), un gruppo di disturbi progressivi e neurodegenerativi nell'uomo che includono kuru, malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD), Gerstmann-Sträussler-Scheinker Sindrome (GSS) e insonnia familiare fatale (FFI).

PrPSc è anche responsabile della malattia da deperimento cronico (CWD) nei cervidi; encefalopatia spongiforme bovina (BSE) nei bovini e suoi analoghi nelle antilopi e nei felidi selvatici; scrapie nelle pecore e nelle capre; encefalopatia del visone trasmissibile (TME) nel visone allevato nel ranch; e encefalopatia spongiforme felina (FSE) nei gatti domestici. L'evento molecolare chiave nella patogenesi delle malattie da prioni è la conversione conformazionale di PrPC in PrPSc. In un processo non completamente compreso, PrPSc si lega a PrPC e ne promuove la trasformazione in PrPSc. Alla fine, l'isoforma proteica anormale porta alla neuro degenerazione e alla morte cellulare, e di conseguenza molti buchi microscopici simili a spugne (vacuoli) possono essere visti nel cervello, un sintomo della malattia da prioni.

Scrapie fu la prima malattia da prioni ad essere identificata negli anni 1730. Successivamente sono state descritte altre malattie da prioni: GSS (1920); CJD (1920s); kuru (1952–1953, tra le Fore della Papua Nuova Guinea, trasmesso tramite cannibalismo rituale); CWD (1967); e la più recente malattia animale più grande: la BSE (1987). Le malattie da prioni sono classificate come: (1) sporadiche (insorgono spontaneamente senza motivo noto, con un'incidenza 1 per 106 abitanti all'anno); (2) ereditato (con un'incidenza di 1 per 107-108 abitanti all'anno); e (3) acquisiti (mediante procedure mediche o alimenti contaminati).
Le malattie da prioni si verificano in tutto il mondo e colpiscono entrambi i sessi allo stesso modo.

2. The Human Prion Protein Gene (PRNP)
Il gene PRNP umano si trova sul braccio corto del cromosoma 20 tra l'estremità di questo braccio e la posizione 12 (p12-pter). La struttura del gene prionico per tutte le specie di mammiferi finora studiate contiene tre esoni. La cornice di lettura aperta (ORF) si trova interamente all'interno dell'esone 3 e trascrive un m-RNA di lunghezza 2,1–2,5 kb, con circa 50 copie / cellula nei neuroni.
Ad oggi, non sono state segnalate mutazioni associate alla malattia da prioni nell'esone 1 o 2, o all'interno di nessuno degli introni. I codoni da 51 a 91 del gene PRNP codificano un nona-peptide (PQGGGGWGQ) seguito da quattro ripetizioni di octa-peptidi (PHGGGWGQ), che sono quasi identici al nona-peptide tranne per l'omissione di una glicina e la presenza di un’istidina invece di una glutammina alla seconda posizione. Sono state trovate varie mutazioni di inserzione nella regione di ripetizione dell'otta-peptide.

Finora questi inserimenti comprendono da una a nove ripetizioni di ottapeptidi extra. Gli studi di spettroscopia Raman hanno dimostrato che il legame degli ioni rame (Cu2 +) alle ripetizioni di ottapeptidi in PrP è coordinato da residui di istidina, suggerendo che questa regione può essere coinvolta nel trasporto di ioni Cu2 + extracellulari in un compartimento endosomiale.
Le mutazioni del gene PRNP possono causare lo sviluppo di malattie da prioni e portare a diversi fenotipi clinici, tra cui CJD, GSS e FFI. Le mutazioni del gene della proteina prionica possono essere classificate come: (1) mutazioni puntiformi (cioè sostituzioni di singoli nucleotidi), che possono causare un cambiamento di aminoacidi (mutazione missenso), possono essere silenziose (non causare alterazioni nella sequenza degli aminoacidi), o meno comunemente può causare la terminazione prematura del codice (stop o mutazione senza senso); e (2) inserzioni ed eliminazioni, che sono associate a malattie da prioni.

3. Origini evolutive del PRNP
Recentemente è stato proposto che l'emergere del gene fondatore della proteina prionica fosse basato su due riarrangiamenti genomici avvenuti centinaia di milioni di anni fa. Il primo evento si è verificato all'interno dell'ecto dominio N-terminale di un gene predecessore ZIP, quando i metazoi sono emersi per la prima volta sul pianeta. Come conseguenza di questo riarrangiamento, all'interno di questo ecto dominio è stata generata una regione di nucleo affiancato da cisteina (CFC). Il secondo evento, che ha permesso di risalire alla creazione del gene fondatore della proteina prionica, si è verificato circa mezzo miliardo di anni fa (attorno all'esplosione cambriana).

Questo evento successivo ha portato all'apparente retro-inserimento genomico di una trascrizione del gene ZIP giuntato e troncato C, che indica che il gene fondatore della proteina prionica è equivalente a un retro gene. Una precedente indagine che utilizzava un'analisi quantitativa dell'interoperoma identificava ZIP6 e ZIP10 come potenziali interattori molecolari di PrP sulla superficie cellulare, rivelando che le proteine prioniche note sono strutturalmente correlate a un dominio extracellulare di ZIP6 e ZIP10. Allo stesso modo, altri autori che utilizzano analisi dell'interomeoma hanno identificato interazioni multiple tra PrPC e altre molecole, come la molecola di adesione delle cellule neurali (NCAM), il precursore del recettore della laminina, ATPasi Na / K e isomerasi di disolfuro di proteine (PDI). Insieme, questi risultati suggeriscono che PrPC organizza il suo ambiente molecolare legando le molecole di adesione, che a loro volta riconoscono le proteine di membrana portatrici di oligomannosio. Più di 30 mutazioni nel gene PRNP sono state collegate a malattie prioniche ereditarie, tra cui CJD, GSS e FFI.

Inoltre, sono stati identificati diversi polimorfismi comuni (variazioni) nel gene PRNP (Figura 1). Le mutazioni possono portare a un cambiamento di un singolo aminoacido in PrP, inserire ulteriori residui o causare l'espressione di una versione anormalmente breve di PrP. Queste mutazioni influenzano la struttura primaria di PrP, possono portare a cambiamenti nella struttura secondaria e terziaria e possono provocare l'emergere di confomeri PrPSc. Al contrario, i polimorfismi non causano la malattia da prioni, ma possono influenzare il rischio di una persona di sviluppare una malattia da prioni. Il polimorfismo più comune e meglio studiato nella PrP umana si verifica al codone 129 e funge da fattore predisponente per la CJD sporadica, iatrogena e variante. Metionina (M) o valina(V) è codificato in questa posizione. L'omozigosi M / M in questa posizione sembra essere associata a un'età precoce di insorgenza e demenza rapidamente progressiva; mentre un decorso più prolungato con esordio atassico è spesso associato all'allele V / V.

È importante evidenziare che le frequenze alleliche al codone 129 differiscono tra le popolazioni, ad esempio rispetto alle frequenze caucasiche di M (0,66): V (0,34), le frequenze alleliche riportate in Giappone sono M (0,96): V (0,04), e sebbene della malattia non sia stata segnalata essere più alta in Giappone, può predisporre un individuo a sviluppare un particolare fenotipo clinico.

Figura 1. Rappresentazione schematica di mutazioni e polimorfismi della PrP umana. L'ORF di 0,76 kb del gene PRNP codifica una proteina amminoacidica 253, PrPC. Il PrP umano è costituito da un peptide di segnale separato (1–22), un dominio dispiegato contenente ripetizione di ottapeptidi (OR, 51–91), tre eliche α (H1, H2 e H3), un piccolo foglio β antiparallelo (β1 e β2) e un segnale di ancoraggio GPI (232–253). Il motivo di ripetizione dell'otta-peptide N-terminale è composto da otto residui: P (H / Q) GGG (- / G) WGQ. PrP normale contiene cinque copie di questo motivo; una singola delezione OR è considerata un polimorfismo non patogeno.

Tuttavia, le mutazioni inserzionali costituite da uno a nove OR aggiuntivi sono patogene. I polimorfismi e le mutazioni patogene del gene PRNP sono rappresentati sopra e sotto lo schema, rispettivamente. Le lettere che precedono i numeri indicano il normale residuo di aminoacidi per la posizione e le lettere che seguono i numeri indicano il nuovo residuo. Mentre l'omozigosi M o V al codone 129 nella PrP umana determina una predisposizione alla CJD sporadica o iatrogena, la sostituzione del glutammato (E) alla lisina (K) al codone 219 sembra avere un effetto protettivo contro la s-CJD.

Il polimorfismo E219K è stato riscontrato nella popolazione giapponese con una frequenza allelica del 6%. Questo polimorfismo è stato anche riportato sullo stesso allele della mutazione P102L (vedi sotto) in una famiglia giapponese in cui la demenza piuttosto che l'atassia era prominente e la patologia della placca cerebellare era meno prominente rispetto ai casi della sola mutazione P102L. Recenti studi sui topi knock-in hanno dimostrato che uno stato eterozigote al codone 219 conferisce una ridotta suscettibilità all'infezione da prioni.

4.1. Mutazioni associate a GSS
Questo sottotipo di malattia da prioni è molto raro e associato all'eredità autosomica dominante. Le caratteristiche cliniche includono atassia dell'andatura e / o disartria, demenza, paraparesi spastica e gradi variabili di sintomi piramidali ed extrapiramidali. L'incidenza non è chiara ma è stata stimata da 1 a 10 per 100 milioni. La GSS è stata associata alle seguenti mutazioni missenso: P102L; P105L; A117V; F198S; D202N, Q212P; Q217R, e in alcuni casi di inserti ripetuti di ottapeptidi (OPRI), in particolare quelli con inserti più grandi (circa 192 bp).

4.2. Mutazioni associate a CJD
La CJD è un altro disturbo neurodegenerativo caratterizzato da insufficiente memoria, cambiamenti comportamentali, mancanza di coordinazione e disturbi visivi. Man mano che la malattia progredisce, il deterioramento mentale diventa più pronunciato, possono verificarsi movimenti a scatti, cecità e coma. Questa malattia porta alla morte di solito entro un anno dall'esordio della malattia. Esistono tre categorie principali di CJD:

  • CJD sporadica (s-CJD): il tipo più comune di CJD, che rappresenta almeno l'85% dei casi. La malattia si manifesta anche se la persona non ha fattori di rischio noti per la malattia (ad esempio, nessuna mutazione nel gene PRNP);
  • CJD familiare (f-CJD): rappresentano circa dal 5% al 10% dei casi di CJD. L'individuo ha una storia familiare della malattia e / o test positivi per una mutazione PRNP;
  • CJD iatrogeni (i-CJD): rappresentano meno dell'1% dei casi di CJD. Questa forma di CJD viene trasmessa per esposizione al cervello o ai tessuti da una persona infetta, di solito attraverso una procedura medica, come una trasfusione di sangue o un trapianto di dura madre.
  • f-CJD è stato associato alle seguenti mutazioni missenso: D178N, V180I, T188A, E196K, E200K, V203I, R208H, V210I, E211Q, M232R; e da uno a nove inserti di ottapeptidi.



4.3. Mutazioni associate a FFI
L'insonnia familiare fatale (FFI) è un raro disturbo genetico del sonno, diagnosticato in meno di 40 famiglie in tutto il mondo.
Questa malattia è causata dalla mutazione missenso D178N, ma può anche essere sviluppata spontaneamente in pazienti con una variante sporadica chiamata insonnia fatale sporadica (s-FI).

Il profilo clinico comprende l'insonnia intrattabile che può essere osservata per diversi mesi prima dell’ovvia insorgenza della malattia, che può includere disautonomia, atassia, segni e sintomi piramidali ed extrapiramidali variabili e funzione cognitiva relativamente risparmiata fino a tardi nel corso. La sopravvivenza media per i pazienti con FFI dopo l'insorgenza dei sintomi è di 18 mesi.

5. Biochimica e struttura delle proteine prioniche
Dalla scoperta dei prioni, sono stati fatti molti tentativi per chiarire le differenze strutturali tra PrPC e PrPSc e la conversione patogena che porta alla formazione di PrPSc.
Tecniche biofisiche e biochimiche a bassa risoluzione sono state utilizzate da molti gruppi di ricerca per ottenere approfondimenti sulle conformazioni sia di PrPC che di PrPSc, tuttavia questi approcci presentano limitazioni, come verrà discusso di seguito. PrPC e PrPSc differiscono per quanto riguarda solubilità, tendenza alla formazione di fibrille e resistenza alla proteinasi K.

Il PrPC è una proteina solubile con un'alta suscettibilità alla digestione proteolitica, mentre il PrPSc è caratterizzato dalla sua insolubilità nei detergenti e dalla parziale resistenza alla proteolisi nella sua forma aggregata. Queste differenze sembrano essere basate sulle loro differenze strutturali, poiché studi precedenti basati sul dicroismo circolare e la spettroscopia infrarossa hanno dimostrato che il PrPC è dominato dalle eliche α (42%) e ha solo una piccola parte del contenuto di fogli β (3%), mentre PrPSc contiene prevalentemente fogli β (> 43%). Il PrPSc troncato N-terminale, designato PrP 27–30 ha un contenuto di fogli β superiore (> 54%). Contrariamente al PrP 27–30, che polimerizzava in amiloidi a forma di bastoncino, PrPC non forma aggregati rilevabili mediante microscopia elettronica.

5.1. Struttura del PrPC
La proteina prionica esiste in più conformazioni e la sua isoforma cellulare, PrPC, che si trova in organismi sani, è tra le proteine maggiormente studiate. Nell'uomo, il PrPC appena sintetizzato e non trasformato è lungo circa 253 aminoacidi e ha un peso molecolare di 35–36 kDa (Figura 2). PrPC è ancorato a GPI e risiede in zattere sulla membrana cellulare. Dopo ~ 5 h sulla superficie cellulare (la sua emivita media) viene interiorizzato attraverso un meccanismo dipendente dalle caverne e viene degradato nel compartimento dell'endolisosoma. È stato ipotizzato che la conversione di PrPC in PrPSc possa avvenire in domini.



Figura 2. Organizzazione del PrP umano.

Il PrP non trasformato ha una lunghezza di 253 residui di amminoacidi e comprende un peptide di segnale (1–22), quattro OR, una regione idrofobica (113– 135), un legame disolfuro tra i residui di cisteina (179–214), due glicosilazione N-legata siti (ai residui 181 e 197) e un ancoraggio GPI attaccato al terminale C del PrP in sostituzione del segnale dell'ancoraggio GPI (residui da 232 a 254). I quattro OR nel dominio N-terminale hanno un'alta affinità per gli ioni rame (Cu2 +), mentre un precedente nona-peptide (PQGGGGWGQ) manca dell'istidina necessaria per legare uno ione Cu2 +. Le forme mutate di PrP possono contenere inserimenti da uno a nove OR aggiuntivi o una cancellazione di uno OR. Una regione palindromica, AGAAAAGA (113–120), si trova nella regione idrofobica (113–135) e si ritiene che sia importante nella conversione di PrPC in PrPSc. OPPURE: ripetizione di octa-peptide; GPI: glicofosfatidilinositolo; PK: proteinasi K; CHO: carboidrati. La struttura del PrPC non può essere studiata usando la spettroscopia NMR o la cristallografia a raggi X a causa della bassa resa di proteine ottenuta durante il processo di purificazione.

Questa limitazione è stata superata usando PrP ricombinante (rec-PrP) come surrogato di PrPC, poiché gli studi NMR hanno dimostrato che rec-PrP sembra avere la stessa architettura molecolare di PrPC. Un primo tentativo di prevedere la struttura tridimensionale del PrPC si basava sul dicroismo circolare e sulle misurazioni della spettroscopia infrarossa, proponendo una struttura α-elicoidale a fascio X. Successivamente i gruppi di Wüthrich e James determinarono la struttura del dominio Cterminale, piegato del PrP (amminoacidi 121–231) mediante spettroscopia NMR. Per tutte le specie analizzate, la struttura di rec-PrP è composta da tre eliche α (aminoacidi 144–154, 175-193 e 200– 219) e un piccolo foglio β antiparallelo (aminoacidi 128–131 e 161–164). Ha un peptide di segnale amino-terminale (amminoacidi 1–23), un dominio N-terminale più o meno flessibile (amminoacidi 23–120), un dominio C-terminale ripiegato (amminoacidi 121–231) e un segnale peptide per l'attacco della membrana tramite un ancoraggio di glicofosfatidilinositolo (GPI) (amminoacidi 232– 254). Contiene un unico legame disolfuro che collega i residui di cisteina nelle posizioni 179 e 214, collegando le eliche 2 e 3 e due siti di glicosilazione N-collegati alle asparagine 181 e 197.

Il dominio N-terminale contiene un motivo ripetitivo di otto aminoacidi composto dai residui PHGGGWGQ, che ha un'alta affinità per gli ioni rame (Cu2 +). Pertanto, è stato ipotizzato che il PrPC sia coinvolto nel metabolismo del rame, ma la sua relazione ancestrale con le proteine ZIP suggerisce anche interazioni funzionali con gli ioni zinco (Zn2 +). Quest'ultima ipotesi è supportata dai recenti risultati del gruppo di Glenn Millhauser che suggeriscono che le interazioni elettrostatiche stabilizzano il complesso PrP-Zn2 +. Questi risultati indicano che Zn2 + determina un contatto con la struttura terziaria tra l'otta peptide legato a Zn2 + e la superficie del dominio Cterminale che include molte delle mutazioni del PrP che danno origine a malattie da prioni familiari. Altri risultati della ricerca hanno suggerito che le ripetizioni degli ottapeptidi e la regione polibasica N-terminale nel PrPC mediano l'afflusso di zinco nelle cellule neuronali attraverso i recettori α- ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolepropionato (AMPA), con PrPC che agisce come un sensore di zinco e il recettore AMPA come trasportatore di zinco. Questi risultati suggeriscono anche che l'assorbimento di zinco mediato dalla PrP può contribuire alla neuro degenerazione nel prione e in altre malattie neurodegenerative.

Una sequenza idrofobica nel mezzo della proteina (amminoacidi 113-135) può servire come dominio transmembrana in alcune isoforme di proteine prioniche. All'interno di questo tratto di sequenza si trova una regione palindromica (113-120) costituita da un tratto di aminoacidi ricco di alanina, AGAAAAGA, che è altamente conservato in un'ampia varietà di specie di mammiferi. Precedenti studi rivolti a questa regione hanno dimostrato che la cancellazione di questo palindromo impedisce la conversione di PrP sia di tipo selvaggio mutato che co-espresso (in peso). Inoltre, i peptidi generati da questo palindromo interferiscono con la formazione in vitro della resistenza alla PK. La Figura 3 mostra una rappresentazione schematica di PrPC legato alla membrana cellulare.

5.2. Struttura del PrPSc
Nonostante il grande interesse nel determinare la struttura di PrPSc, si sa poco sui dettagli molecolari di questa isoforma. La struttura ad alta risoluzione di PrPSc e la sua variante troncata proteoliticamente, PrP 27–30, hanno eluso la determinazione sperimentale a causa della loro insolubilità e propensione all'aggregazione.
Tuttavia, è ampiamente riconosciuto che: (1) durante la conversione di PrPC in PrPSc il contenuto di filamento β aumenta sostanzialmente; (2) i gruppi fibrillari di PrPSc presentano una tipica architettura a fogli incrociati β, caratteristica dell'amiloide; (3) la conversione di PrPC in PrPSc aumenta la sua resistenza alla proteinasi K, sebbene questa caratteristica non sia obbligatoria. Ad oggi, i dati generati da metodi biochimici e biofisici, come l'analisi spettroscopica, la microscopia elettronica, la diffrazione delle fibre di raggi X, lo scattering di raggi X di piccolo angolo, la proteolisi limitata, lo scambio di idrogeno / deuterio (H / D) e le misure di reattività superficiale, hanno portato a diversi modelli strutturali 3D di PrPSc. Tuttavia, una recente revisione ha rivelato discrepanze tra i dati sperimentali e questi modelli, indicando che tutti questi modelli non riescono ad accogliere i dati sperimentali.



Figura 3. Diagramma schematico della struttura di PrPC. Le frazioni di carboidrati collegate ad Asn 181 (in basso) e Asn 197 (in alto) sono mostrate in rosa. L'ancoraggio GPI del terminale C è mostrato in verde e si estende nella membrana cellulare in blu e rosso. I residui OR nel dominio Nterminale sono noti per legare ioni rame (mostrati in blu).

Il file di dati compositi per la struttura è stato gentilmente fornito dal Dr. Glenn Millhauser (Università della California, Santa Cruz) e include le coordinate per i carboidrati, l'ancora GPI e la membrana che sono state fornite dalla Dr. Valerie Daggett (Università di Washington, Seattle).

5.3. Modelli molecolari per le strutture di PrPSc e PrP 27–30
Il primo modello strutturale proposto per PrPSc si basava su misurazioni di spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR) su PrP 27–30. Questo modello prevedeva un foglio β a quattro strati coperto su una faccia da due eliche α del terminale C. Tuttavia, successive osservazioni sperimentali hanno indicato che PrPSc sembra non contenere alcuna struttura α-elicoidale residua.
Downing e Lazo hanno suggerito che in PrPSc i filamenti β si proietterebbero da un nucleo di foglio β intrecciato e intrecciato, che a sua volta copre l'altezza di otto filamenti β equivalenti a ~ 38,4 Å. Tuttavia, questo modello contraddice i dati di diffrazione della fibra di raggi X, che indicavano un'altezza molecolare di ~ 19,2 Å. Inoltre, questo insolito modello è diverso da qualsiasi piega proteica nota nel database PDB, il che rende difficile valutarne la plausibilità. Sulla base di microfotografie elettroniche di cristalli 2D di PrP 27–30 e di un mini-prione redatto, PrPSc106, Govaerts e colleghi hanno proposto un modello β-elica parallelo per il nucleo del conformatore infettivo.

Gli autori hanno rilevato una compatibilità tra la regione N-terminale del PrP 27–30 (amminoacidi 89–176) e una struttura parallela β-elica, e hanno proposto che questa regione del PrP potesse essere convertita in una β-elica triangolare contenente quattro spire (modello a quattro gradini). Inoltre, hanno proposto che l'elica β associata ad un fascio C-terminale α2-α3 intatto, che ha mantenuto la sua struttura α-elicoidale dalla piega PrPC. I singoli modelli PrP 27–30 sono stati quindi assemblati in un'unità trimetrica (simmetria p3) utilizzando la parete laterale dell'elica β come interfaccia. Il trimer PrP β-elicoidale può quindi essere facilmente impilato per formare fibrille amiloidi. Come accennato in precedenza, le eliche α del terminale C che sono mantenute nel modello non sono più supportate da dati sperimentali.
Utilizzando simulazioni di dinamica molecolare (MD) e confronti di sequenze, Langedijk e colleghi ha suggerito il modello successivo e alternativo. Ha proposto un numero ridotto di pioli di β-elica per molecola PrPSc che vanno da quattro a due pioli con otto residui in un bordo del triangolo, in contrasto con i cinque residui proposti nel modello precedente. Questo modello ha aiutato a superare i problemi con la densità di impaccamento che comporta un allungamento della sequenza PrP (aminoacidi 106-126) che è ricca di piccoli aminoacidi (glicina e alanina).

Tuttavia, gli svantaggi di questo modello sono: in primo luogo, questo modello mantiene le eliche α del terminale C, che non sono più supportate da dati sperimentali. In secondo luogo, la riduzione del numero di pioli di β-elica determina un'altezza molecolare di 9,6 Å per ogni molecola, il che contraddice l'altezza molecolare osservata sperimentalmente di 19,2 Å (corrispondente a quattro pioli di β-elica). De Marco e Daggett hanno proposto un "modello a spirale" in cui sono state mantenute tutte e tre le eliche α della struttura originale del PrP, mentre il numero di β-fili è stato esteso a quattro.

Usando la struttura di rec PrP come punto di partenza, le fluttuazioni conformazionali durante la sua conversione in condizioni amiloidogeniche (pH acido) sono state simulate usando la dinamica molecolare. Il modello risultante ha proposto un nucleo a spirale di struttura estesa, costituito da tre fili β corti (che coprono gli aminoacidi 116-119, 129–132 e 160–164) e il reclutamento di un filo β nascente (aminoacidi 135–140). I risultati della dinamica molecolare hanno suggerito che il cambiamento conformazionale si è verificato nella regione N-terminale del nucleo piegato di PrP, mentre le eliche C-terminale α2 e α3 sono rimaste intatte. In un modello fibrillare, che è stato costruito da singoli monomeri, i filoni β sono orientati ad angoli non perpendicolari all'asse fibrillico, il che ha reso questo modello incompatibile con i risultati della diffrazione della fibra di raggi X. Allo stesso modo, questo modello contiene un'alta percentuale di struttura α-elicoidale, che di nuovo è incompatibile con i recenti risultati sperimentali.

Tattum e colleghi hanno utilizzato microfotografie elettroniche di fibrille amiloidi cresciute in vitro da rec PrP (aminoacidi 91–231) per generare una ricostruzione 3D. Gli autori hanno trovato densità di due proto filamenti intrecciati con una distanza ripetuta di ~ 60 Å. L'unità ripetitiva lungo ciascun proto filamento suggeriva una struttura fibrillica distinta a forma di scala. Altri ricercatori hanno supportato questo modello a forma di scala, proponendo che sia la regione N-terminale (amminoacidi 89-143) sia la regione C-terminale (amminoacidi 154–227) del nucleo ripiegato del PrP fossero inclini alla conversione in Struttura β indipendente. Un tratto strutturale comune per questi modelli è la presenza di un lungo anello non strutturato che collega i domini β-elicoidali N e C-terminal, che sono stati introdotti per adattarsi all'aspetto a scala delle fibre amiloidi rec PrPP. Tuttavia, questo aspetto simile a una scala è esclusivo di questa particolare preparazione del campione, che non è stato segnalato per generare infettività.

Inoltre, la configurazione a scala non è stata trovata nei campioni di fibrilla PrPSc o PrP 27–30. Cobb e colleghi hanno analizzato l'amiloide rec PrP usando l'etichettatura di spin diretta al sito e la risonanza paramagnetica elettronica (EPR). Sulla base di distanze inter residue (vincoli strutturali), hanno proposto un modello parallelo di fogli β in registro, in cui l'amiloide rec PrP è costituito da filamenti β e curve e / o anelli relativamente corti senza elica α residua. Inoltre, ogni molecola di PrP contribuisce solo con 4,8 Å alla lunghezza della fibrilla amiloide. Gli autori postulano inoltre che la regione C-terminale (aminoacidi 159–219 nel PrP di topo) viene convertita in una struttura a forcina e che le fibrille sono formate come un lungo foglio β a due strati. Sebbene alcuni ricercatori abbiano adottato questo modello per spiegare la struttura del PrPSc, non è stato riportato che questa preparazione amiloide rec PrP produca infettività e il modello non è correlato alla dimensione unitaria ripetitiva di 19,2 Å osservata da esperimenti di diffrazione di fibre di raggi X su PrPSc e PrP 27–30.

Allo stesso modo, un recente studio che utilizza la spettroscopia NMR a stato solido (ss NMR) per analizzare la formazione di fibrille amiloidi recrP che sono state seminate con PrPSc, ha proposto che anche il nucleo C-terminale, fiancheggiato da cisteina che contiene le eliche α 2 e 3 un'architettura parallela in β-sheet in registro. Gli autori hanno determinato lo spazio tra le isole marcate isoleucina (Ile-1-13C), fenilalanina (Phe-1-13C) e leucina (Leu-1-13C) nell'amiloide rec PrP e hanno osservato una distanza di ~ 0,5 nm per quattro residui di Ile (182, 184, 203 e 205). Sulla base di questa osservazione, gli autori hanno concluso che questi residui si ripiegano da una struttura a-elicoidale in un foglio β intermolecolare in registro parallelo. I tre residui di Phe (140, 174 e 197) hanno mostrato una distanza intermolecolare di 0,5-0,6 nm, suggerendo che i due terzi dei residui di Phe erano impilati in registro, ma che un terzo no. Tuttavia, questi risultati non sono correlati con l'altezza molecolare di 19,2 Å osservata nelle fibrille amiloidi PrPSc e PrP 27–30. Inoltre, non è stato dimostrato in che misura l'amiloide rec PrP seminato con PrPSc assomigli a PrPSc derivato dal cervello rispetto all'infettività e alla struttura.

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